Eesti Looduse fotov�istlus
2005/3



   Eesti Looduse
   viktoriin




   AIANDUS.EE

Eesti Loodus
Intervjuu EL 2005/3
Stress paneb bakterite maailma liikuma

Maia Kivisaar (1960) on sündinud Harjumaal Kosel. Lõpetas 1978 Vändra keskkooli ja 1983 Tartu ülikooli bioloogina geneetika erialal. Olnud Tartu ülikoolis 1983–1985 geneetika ja tsütoloogia kateedri nooremteadur, 1986–1991 plasmiidibioloogia labori nooremteadur ja teadur, 1991–1992 molekulaar- ja rakubioloogia instituudi nooremteadur ja teadur ning alates 1993 samas instituudis dotsent. 1992 kaitses Tartu ülikooli juures filosoofiadoktori kraadi molekulaarbioloogia erialal. Avaldanud uurimusi molekulaarbioloogia ja geneetika valdkonnast. Eesti vabariigi teaduspreemia 1992 (autorite kollektiivi liikmena) ning 2005, viimati uurimuste tsükli eest “Bakterigenoomi mutagenees-adaptatsiooni­mehhanism keskkonna stressi tingimustes”.

Kuidas äsja teaduspreemia saanud tööde tsükli pealkirja saaks lihtsamalt seletada?


Uurime eelkõige evolutsiooniprotsesside molekulaarseid mehhanisme. Kasutame mudelsüsteemina lihtsaid organisme, baktereid. Nad paljunevad kiiresti ja nii saame lühikese aja jooksul vaadelda paljusid põlvkondi. Kui bakterirakkudes tekivad mutatsioonid, siis satuvad need rakud kohe valiku alla.

Kasulike mutatsioonidega rakud paljunevad populatsioonis edukamalt. Kui viia bakterid laboris keskkonda, kus saavad kasvama hakata ainult mutandid, tekib igast mutantsest rakust tardsöötmele bakterikoloonia, millest on võimalik isoleerida rakke ja uurida nende genoomis toimunud muutusi.

Peale selle on bakterites lihtne eri geene välja lülitada või muuta nende avaldumise taset ning seejärel vaadata, kas ja kuidas need muutused mõjutavad rakkude muteerumisvõimet ja mutatsioonide tüüpi.

Meid, nagu ka mitmeid teisi uurimisrühmi maailmas, on viimastel aastatel huvitanud see, kas stressi tingimustes, näiteks toitainete puudusel, on olemas mingisugused mehhanismid, mis suurendavad rakkudes mutatsioonide sagedust. Stressiseisundis rakkudes tekib DNA-sünteesil rohkem vigu ning neid parandatakse vähem. Niimoodi suureneb mutatsioonisagedus ja ühtlasi kiireneb rakupopulatsiooni võime muutunud keskkonnatingimustega kohastuda.

Mõnede geenide liiga kõrge avaldumistase suurendab mutatsioonisagedust. Siin võib näiteks tuua geenid, mis kodeerivad DNA replikatsiooni teostavaid valke – DNA polümeraase. Osa DNA polümeraasidest teeb DNA kopeerimisel tunduvalt enam vigu kui teised. Kui sellise vigaderohke DNA polümeraasi hulk rakus kasvab, suureneb ka mutatsioonisagedus. Samas on rakus olemas ka DNA reparatsioonisüsteemid, mis kõrvaldavad DNA sünteesi käigus tekkinud vigu. Juhul, kui mõni DNA reparatsiooniga seotud geenidest kaotab aktiivsuse, suureneb mutatsioonisagedus rakkudes kuni tuhat korda.


Sellel teadmisel on kindlasti ka oluline rakenduslik väljund?


Kui mikroobide evolutsioneerumist laiemalt vaadata, siis näeme tõesti mitmeid praktilisi probleeme. Näiteks ka inimese organismi sattunud patogeeni kasv on samuti mitmetel põhjustel piiratud. Ta ei saa piisavalt toitaineid, peab võitlema teiste bakteritega elukeskkonna pärast, samuti organismi immuunsüsteemiga, võimaliku antibiootikumraviga jne.

Neis stressitingimustes suureneb ka patogeensete bakterite mutatsioonisagedus. Kõneldakse tuberkuloosi multiresistentsetest tüvedest või tüstilise fibroosi patsientidest, kellel on krooniline Pseudomonas aeruginosa infektsioon: nad põevad pidevalt kopsupõletikku ja seda on võimatu tagasi tõrjuda, kuna bakterid on kiiresti evolutsioneerudes muutunud multiresistentseks.

Siiski oleme eelkõige uurinud eelmainitud P. aeruginosa’ga lähedases suguluses olevat mittepatogeenset liiki P. putida. Mittepatogeensete bakteritega on lihtsam töötada ja mudeli põhjal saab teavet üldistada laiemalt.


Mis sellist mutatsioonisageduse kasvu ikkagi põhjustab?


Kui võtame vaatluse alla geenid, mis kodeerivad näiteks DNA sünteesil vajaminevaid valke, siis on teada, et selliste geenide avaldumistase võib vastusena stressile tõusta. Püüame aru saada, mis polümeraasid ja millistel tingimustel võiksid olla aktiveeritud ja vaatame kaitsemehhanisme, mis vigu kõrvaldavad: kui tõhusalt nad stressis rakkudes töötavad.

Väga oluline komponent on mobiilsed geneetilised elemendid, transposoonid. Enamasti on nende liiga sage ümberpaiknemine genoomis kahjulik, kuna nad võivad liikuda rakule eluliselt tähtsate geenide sisse ja neid inaktiveerida. Seetõttu hoitakse rakkudes transposoonide genoomisisene ümberpaiknemine tavaliselt hästi madalal tasemel, et ära hoida kahjulike mutatsioonide kuhjumist.

Kuid mõni kord võib nende ringihüppamisega kaasneda genoomis ka kasulikke mutatsioone. Mõne transposooni puhul on leitud, et stressi tingimustes suureneb nende transpositsioonisagedus rakkudes oluliselt. Siit tekib küsimus: kas sellistel juhtudel pole enam kontrollmehhanisme, mis suudaksid transpositsioonitaset all hoida või on evolutsioonis välja kujunenud lausa strateegiad, et stressitingimustes oleks transpositsioonisagedus suurem.

Osa meie viimastel aastatel ilmunud töid käsitlebki transpositsiooni regulatsiooni stressis olevates rakkudes. Meie uuritav transposoon Tn4652 aktiveerub nälgivates bakterirakkudes. Transposooni Tn4652 uude kohta liikumise tõttu võivad tekkida transposooni otsast ja märklaud-DNAst liitjärjestused, mis toimivad promootoritena. Juhul, kui selline promootor tekib geeni ette, mida enne ei transkribeeritud, muutub võimalikuks geeni avaldumine. See on üks näide, kuidas transponeerumine võib rakule kasulikuks osutuda.


Miks see transposoon aktiveerub just nälgivates rakkudes?


Muutused nälgiva raku ainevahetuses toimuvad väga kiiresti: pärsitakse paljusid geene, samal ajal aga lülitatakse tööle need geenid, mille avaldumine on vajalik just stressitingimuste üleelamiseks. Tegemist on füsioloogilise kohastumusega, kus teatud regulaatorvalgud kontrollivad geenide avaldumistaset, ilma et oleks toimunud muutusi genoomis.

Näiteks, kui rakkude kasv peatub ehk rakud on statsionaarses faasis, tõuseb neis ligikaudu saja geeni avaldumistase tänu sigmafaktorile RpoS, mis on aktiivne just statsionaarse faasi rakkudes ja võimaldab RNA polümeraasil seonduda ainult teatud tüüpi promootoritele. See on üldine vastus stressile, mille käigus muutub rakus paljude geenide avaldumistase, kaasa arvatud ka neil geenidel, mis mõjutavad meie uuritud transposooni Tn4652 liikumist genoomis.

Peale transpositsioonist põhjustatud mutatsioonide tekib genoomis ka punktmutatsioone, kus DNA-s on toimunud kas nukleotiidipaaride asendused või „raaminihke mutatsioonid“, mida on põhjustanud mõne nukleotiidipaari lisandumine või kaotsiminek. Eritüübiliste punktmutatsioonide tekkega on seotud erinevad vigaderohked DNA polümeraasid.

Hiljuti avaldasime artikli, mis käsitleb vigaderohke DNA polümeraasi Pol IV osalust stressist põhjustatud mutageneesil bakteris P. putida. Leidsime, et see polümeraas on oluline ainult raaminihke mutatsioonide tekkel, kusjuures sellest polümeraasist sõltuv mutatsioonisagedus suureneb ligikaudu kümme korda alles siis, kui rakud on viibinud toitainete näljas vähemalt nädal aega.

Siinkohal oleks sobilik rõhutada seda, et looduses ongi bakterite pikaajaline nälgimine pigem norm kui erand. Selleks et uurida, kuidas bakterigenoom looduses evolutsioneerub, tuleks ka laborikatsetes senisest enam pöörata tähelepanu protsessidele niisugustes rakkudes, mis on olnud pikka aega stressis.


Sageli tehakse katseid vaid soolekepikesega. Kui palju erinevad teiste bakterite samalaadsed mehhanismid?


Laias laastus on stressivastuse ja vigaderohke DNA sünteesi mehhanismid ikkagi sarnased. Kui uurida nähtust ühes bakteris, siis ei pruugi kõiki võimalusi näha. Näiteks soolekepikeses leidub selliseid polümeraase, mis teistes bakterites pole nii laialt levinud ning vastupidi. Seetõttu on hea, kui nähtusi vaadatakse laiemalt.

Viimastel aastatel pole soolekepike enam ainus mudelobjekt. Varem, enne genoomide sekveneerimise aega oli teda geneetiliselt kõige enam uuritud. Nüüdseks on määratud paljude bakterite genoomide primaarstruktuur (nukleotiidne järjestus). Lihtsam on esitada küsimusi, kui tead midagi uuritava genoomi kohta: siis on võimalik geene isoleerida, välja lülitada või nende ekspressiooni taset muuta.

Tean omast käest, kuivõrd täpsemaid küsimusi sai hakata esitama pärast seda, kui avaldati bakteri P. putida genoomi järjestus. Nüüd, kui kolme Pseudomonas’e liigi genoom on sekveneeritud, on nende bakterite uurimine üha enam hoogustunud. Pseudomonaadid on looduses üldse üks kõige arvukamaid laiemalt levinud bakterirühmi. Siia kuulub nii taime- ja loomapatogeene kui ka saprofüütseid mullabaktereid.

Viimasel bakterite molekulaarbioloogiat käsitleval EMBO konverentsil oli juba üle poolte ettekannetest seotud just pseudomonaadidega. Eelmisel aastal ilmus Pseudomonas’est kolmeköiteline raamat, kus eri valdkondade asjatundjad käsitlevad neis bakterites toimuvate bioloogiliste protsesside molekulaarseid mehhanisme.

Üks uuringute liikumapanev jõud on meditsiiniline huvi: viimastel aastatel on palju töid ilmunud mükobakteritest, kuhu kuulub näiteks tuberkuloositekitaja Mycobacterium tuberculosis. Väga palju on hakatud tegelema P. aeruginaosa’ga, kes on oportunistlik patogeen.


Teaduspreemia anti nimeliselt küll ühele uurijale, ent ilmselt on selle taga mitme inimese töö?


Peab rõhutama, et molekulaarbioloogias ei saagi keegi üksinda midagi ära teha: see on rühmatöö. Kuid teaduspreemiale esitamisel selgus, et soovitatavalt peaksid rühmas olema kõik doktorikraadiga inimesed. Meil aga mitu inimest alles kirjutavad oma doktoritööd. Nii või teisiti on teaduspreemia tunnustus kogu uurimisrühmale.


Millised on teie uurimisrühma teadustöö põhisuunad?


Üks olulisemaid ongi mikroobipopulatsioonide geneetilise adaptatsiooni uurimine. See uurimissuund sai meil jalad alla tänu HHMI (Howard Hughes Medical Institute) toetusele programmi raames, mis jagab viieaastaseid uurimistoetusi Ida-Euroopa ja Nõukogude Liidu koosseisu kuulunud riikide teadlastele, kes tegelevad bioloogiliste protsesside alusuuringutega, millest tulevikus võiks kasu olla ka biomeditsiinile. Konkurss oli päris tugev, kuid TÜ molekulaar- ja rakubioloogia instituuti ja Eesti biokeskusesse tuli sealt kolm uurimistoetust.

Varem uurisime peamiselt fenooli lagundamist määravate geenide transkriptsiooni regulatsiooni bakteris P. putida. Selgus, et fenooli degradatsiooniraja ekspressiooni mõjutab tugevalt bakterite kasvukeskkond: fenooli katabolismiraja geenide transkriptsiooni takistatakse toitainerikkas kasvukeskkonnas ja indutseeritakse kiiresti, kui bakterid on stressis. Millised on sellise füsioloogilise kontrolli molekulaarsed mehhanismid – see küsimus on ikka päevakorral.


Kuidas paistab teie uurimisrühm teiste maade taustal?


Publitseerimise edukus on ilmselt üks näitajaid. Oma eriala põhilistes ajakirjades, mida kõik loevad, oleme omi artikleid avaldanud. Arvatavasti on mingi näitaja ka see, et mul paluti kirjutada mutatsiooniprotsesse käsitlev peatükk eelmainitud Pseudomonas’e-monograafiasse.

Kõige tugevamad on sama valdkonna uurimisrühmad Ameerika ühendriikides. Seal on olnud alusuuringuteks lihtsam raha saada. Senine teaduse finantseerimise süsteem Euroopas on soosinud eeskätt rakenduslikke uuringuid, kus töö on jaotatud paljudes riikides tegutsevate laborite vahel. Kahjuks jagavad raha rohkem Brüsseli ametnikud kui teadlased. On lootust, et tulevikus hakkab midagi siiski muutuma.

Meie rühm on siiani saanud suuremad välistoetused USAst. Oleme saanud toetust ka Eesti teadusfondilt. See aitab muu hulgas kraadiõppuritele stipendiume maksta. Noortel inimestel on raha ikka tarvis ja kui nad ei saa seda siit laborist, siis peavad nad kuskil mujal töötama, ning tulemused kannatavad.


Töötegijaid ikka jätkub?


Kui võrrelda muu maailmaga, siis meil on väga suur osa kraadiõppuritel. Siia on sattunud väga tublisid inimesi, ka selliseid, kes juba ülikooli teisel aastal on hakanud siin edukalt töötama.

Mujal teevad samasugust tööd enamasti järeldoktorid. Meil on küll mõned teadurid, kes on doktoritöö kaitsnud ja pole mingil põhjusel välismaale järeldoktorantuuri läinud, vaid jätkavad siin oma tööd. Kuid võimalusi leida raha, et kutsuda siia inimesi väljastpoolt Eestit järeldoktorantuuri, kes selleks, et häid artikleid saada, siin kolm aastat palehigis tööd teeksid, oli enne Eesti ühinemist Euroopa Liiduga üsna vähe.


Kui võrrelda varasemate aastatega, kas üliõpilaste tase on muutunud? Kas noored on nüüd targemad?


Arvan küll, et võrreldes näiteks minu õpinguajaga on tase kindlasti paranenud. Nad saavad tunduvalt rohkem erialaaineid, mis isegi omavahel kattuvad. Kuid kordamine nüansse lisades ei tee kunagi halba. Sel ajal, kui mina ülikoolis õppisin, oli palju selliseid aineid, millega hiljem polnud midagi peale hakata.

Praegu on tavapärane, et näiteks ajakirjas Science ilmub uus info, õppejõud loeb seda Internetist ja kahe tunni pärast räägib sellest loengus. Varem info nii kiiresti kohale ei jõudnud.


Kui palju Te üliõpilasi õpetate, loenguid peate?


Üksjagu, sest olen Tartu ülikooli dotsent. Ametlikult peaks aasta ringi iga päev olema õppetööd, ent tegelikkuses õnnestub seda siiski nii sättida, et aega jääb ka teadusele. Samas aga, kui õppetöösundi ei oleks, võib kergesti juhtuda, et jääd liiga kitsalt ainult oma erialasse kinni.

Siin geneetika õppetoolis loen kaht üldkursust, millest geneetika I on kogu teaduskonna tudengitele ja ka väljapoole. Näiteks selle aasta loengutele on end kirja pannud üle kolmesaja kuuekümne tudengi. Kui loeng on korra ette valmistatud, siis selle pidamine ükskõik kui suurele üliõpilaste hulgale on lihtne. Edaspidi tuleb materjali muidugi täiendada, sest uut infot tuleb pidevalt. Kõige suurem vaev õppejõule on hinnata sellise suure hulga tudengite eksamitöid.

Geneetika II on juba rohkem erikursus, seal jääb tudengite arv saja piiresse, enamasti bioloogid ja geenitehnoloogid. Üks mu kitsam erikursus käsitleb bakterite molekulaarbioloogiat. Seal on vaatluse all kõik bioloogilised protsessid bakterites, geeniregulatsiooni eri tasandid, rakutsükli kontroll ja replikatsioon bakterite eri kasvutingimuste puhul.


Riigi teaduspreemia saite ka 1992. aastal. Kas uurimissuunad on vahepeal muutunud?


Uurimissuundadest oli juba juttu, kuid päris esimestest töödest tõesti mitte. Kunagi alustasin Ain Heinaru juures fenooli lagundavatest bakteritest. Minu esimene uurimisteema oli seotud fenooli lagundamist määravate geenidega. Leidsin, et need geenid paiknesid kromosoomivälistes geneetilistes elementides – plasmiidides. Edasi õnnestus vastavad geenid isoleerida ja täpsemalt iseloomustada.

Aastate eest oli suur tulekahju põlevkivikaevanduses. Siis sai siit pärit baktereid keskkonda lastud ja fenoolide hulk selle tõttu vähenes. Artiklid, mis käsitlesid fenoolsete ühendite lagundamise geneetilisi aspekte mikroorganismides, oli üks osa uurimistööst, mis sai 1992. aastal teaduspreemia.

Mudelobjektiks on meil ikka jäänud Pseudomonas putida. Kuid bakterite geneetilise kohastumise uurimine stressitingimustes on tõesti uus teema. Inspiratsiooni sai see 1990ndate aastate esimesel poolel ajakirjades Science ja Nature ilmunud töödest, kus räägiti adaptatiivsetest mutatsioonidest. Soolekepikest näljutati: tal polnud võimet süüa laktoosi. Kuid laktoosi keskkonnas tekkisid neil mutatsioonid, mis võimaldasid seda tarbida. Kuidas oli see võimalik, sest kui neid niisama näljutati, ei saadud selliseid mutante kätte.

Nägime ka oma uuritavatel bakteritel, et teatavates tingimustes tekivad fenooli lagundavad mutandid kergesti. Tekkis huvi neid tekkepõhjuseid teada saada. Leidsime, et kui bakterid olid juba enne olnud stressikeskkonnas, siis sellisesse rakupopulatsiooni ilmus mutante sagedamini.


Tavapärane küsimus: kas tippteaduse kõrvalt jääb Teil aega ka harrastuste jaoks?


Aeg-ajalt lihtsalt peab muude asjadega tegelema. Mul on harrastuseks saanud aeroobika- või tantsutrennis käimine: kui vähegi võimalik, siis lähen õhtul sinna. Kindlasti on vaja leida aega, et lugeda ilukirjandust, ning mõnikord sõpradega kokku saada ja suvel reisimas käia. Teatud perioodid on muidugi töisemad, kuid inimene käib maha, kui ta üldse midagi muud peale teaduse ei harrasta. Eriti tuntav on see kirjatöid tehes: kui ikka silm juba kinni vajub, siis järgmisel päeval vaadates ei kannata nii tehtud tekst kuigivõrd kriitikat.



Geneetikut ja molekulaarbioloogi Maia Kivisaart küsitlenud Toomas Kukk
28/11/2012
26/11/2012
05/10/2012
09/07/2012
26/06/2012
26/06/2012
22/05/2012